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    禽傳染性支氣管炎病毒類木瓜蛋白酶的結構和功能分析

    來源:原創論文網 添加時間:2020-04-14

      摘    要: 禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)類木瓜蛋白酶(PLPs)具有多項生物學功能,其對病毒的感染與復制起著重要作用,影響病毒的致病性,并參與病毒抗宿主的天然免疫反應。文章就PLPs的結構與功能進行綜述,以期為深入理解IBV的致病機制提供新的科學證據,也為研發IBV重組病毒疫苗提供新的設計思路。

      關鍵詞: 禽傳染性支氣管炎病毒(IBV); 類木瓜蛋白酶(PLPs); 基因組; RNA病毒; 疫苗;

      禽傳染性支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)是冠狀病毒(Coronavirus)家族的一員,屬于包膜型正鏈RNA病毒。IBV以及其他冠狀病毒的基因組一般編碼兩大類蛋白:結構蛋白和非結構蛋白(Non-structural protein, nsp)。結構蛋白主要起到包裹病毒、保護病毒基因組等功能,而nsp則對病毒的復制轉錄過程起決定性作用。其中非結構蛋白3(nsp3)是冠狀病毒編碼的最大的多功能蛋白,含多個功能區,其類木瓜蛋白酶(Papain-like proteases,PLPs)功能區具有酶切活性,可以將病毒的兩個多聚蛋白PP1a和PP1ab剪切成獨立的蛋白單元參與到病毒轉錄和復制的過程中。此外,PLPs還具有去泛素化和頡頏干擾素的功能,參與病毒抗宿主反應。因此,研究PLPs的結構和功能將會為IBV的防制提供重要的生物學信息和可行的途徑。

      1、 禽傳染性支氣管炎病毒基因組結構特點

      IBV 屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬,為γ冠狀病毒的代表毒株[1],是有囊膜的、不分節段的單股正鏈 RNA病毒,其核酸具有侵染性,全長約27.6 kb。IBV病毒粒子直徑為90~200 nm,呈多邊形、圓形或球形,囊膜表面均勻排列成直徑為10~25 nm的花冠狀纖突,使病毒粒子呈皇冠狀。經連續多次傳代,已適應在Vero細胞中生長繁殖的IBV-P65也可感染人類細胞系H1299和Huh[2]。IBV基因組至少有10個明顯的開放閱讀框(ORF), 現已確定的定位次序是5′-1a-1b-S-3a-3b-3c(E)-M-5a-5b-N-Poly(A)-3′。病毒感染宿主細胞后,近3′端基因編碼4個結構蛋白:纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N),以及多個特異性的輔助蛋白;位于基因組近5′端的復制酶基因編碼2個大的多聚蛋白PP1a 和PP1ab。在細胞中,PP1a和PP1ab經病毒編碼的2,3個蛋白酶加工,生成15,16個nsp,參與病毒復制-轉錄復合體的構建以及病毒RNA的合成[3,4,5]。IBV基因組結構見圖1[6]。
     

    禽傳染性支氣管炎病毒類木瓜蛋白酶的結構和功能分析
     

      2、 PLPs結構

      2.1、 PLP1結構

      IBV nsp3內含多個功能區,主要包括1或2種類木瓜蛋白酶(簡稱PLP1和PLP2)以及多個保守的功能區:N端富含酸性氨基酸的AC區,也稱高變區(hypervariable region, HVR),具有ADP-ribose-1磷酸酶(ADP-ribose-1-phosphatase, ADRP)活性的X區以及富含Cys/His的Y區和跨膜區[7]。PLP1只存在于α冠狀病毒屬和β冠狀病毒屬2a亞組病毒中,包括人類冠狀病毒HCoV-229E和HCoV-NL63,豬傳染性胃腸炎病毒 (Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和鼠肝炎病毒 (Murine hepatitis virus, MHV)等,但β冠狀病毒屬2b亞組中的嚴重急性呼吸綜合癥病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)和2012年發現的新型人類冠狀病毒HCoV-EMC/2012并不編碼PLP1。γ冠狀病毒屬的IBV雖然保留了PLP1區,但它已喪失切割PP1a和PP1ab的蛋白酶活性[8,9]。對TGEV PLP1的結構分析結果表明,PLP1類似于一只伸展的右手,帶有拇指、手掌和手指結構域,其手指結構域含有催化三聯體Cys32-His183-Asp196以及一個由4個半胱氨酸殘基構成的鋅指結構域(Cys103、Cys105、Cys131和Cys134),負責對病毒的多聚蛋白進行切割。TGEV PLP1晶體結構見第158頁彩圖2。此外,一個典型的氧陰離子穴存在于TGEV 的PLP1中,由具有催化活性的半胱氨酸殘基的主鏈和谷氨酰胺殘基(Gln27)的副鏈組成,這一氧陰離子穴的存在對PLP1酶的穩定性起著重要作用。PLP1的空間折疊方式類似于SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome,MERS-CoV)中PLP2的折疊方式,最大的不同點在于鋅指結構域,該結構域的折疊方式比較靈活[10]。基于不同冠狀病毒nsp3的序列比對分析結果發現,IBV-P65的PLP1位于AC和ARDP兩個保守的功能區之間,含519個核苷酸(3 022~3 540 nt),編碼173個氨基酸(159~331 aa,從nsp3 N端的第1個氨基酸算起)[8]。序列比對結果表明,不同血清型和致病型IBV的PLP1氨基酸序列之間變異非常大,存在著點突變、缺失和多達26個氨基酸殘基的插入(如在LX4毒株中)。利用BLAST對更多IBV分離物PLP1的序列進行比較分析,N端64個和C端12個氨基酸是相當保守的(同源性92%~100%),而介于兩者之間的為氨基酸高變異區。

      圖1 IBV基因組結構圖
    圖1 IBV基因組結構圖

      圖2 TGEV PLP1晶體結構[7]
    圖2 TGEV PLP1晶體結構[7]

      圖3 IBV PLP2結構[11]
    圖3 IBV PLP2結構[11]

      2.2、 PLP2結構

      PLP2存在于所有的冠狀病毒屬病毒中,對IBV PLP2的結構分析結果表明,其包含4個不同的結構域(見第158頁彩圖3),起始的56個殘基折疊成一個泛素樣(ubiquitin-like,Ubl)區域,其他3個結構域類似伸展的右手拇指、手掌和手指,三者緊密相連形成一個球狀結構[11]。Ubl 結構域主要由類似于泛素的β折疊結構組成;拇指區主要為α螺旋結構,包含6個α螺旋和2個排列成莖環結構的短β鏈,這一莖環結構使拇指區和手掌區相連;手掌結構域由7個β鏈組成;手指結構域由3個長β鏈和2個短β鏈組成,3個長β鏈突出于該蛋白外,使得在拇指和手指的連接處形成一個疏水的腔隙,這一結構可影響PLP2的功能。PLP2的催化位點與PLP1類似,包含典型的Cys-His-Asp催化三聯體,Cys殘基位于拇指子域;His和Asp殘基位于手掌子域,負責裂解病毒復制酶基因編碼的多聚蛋白。其另一個必不可少的特征是鋅指結構域,由4個來自于手指結構域、2個β莖環結構的半胱氨酸殘基組成,該區域對PLP2結構的穩定性及蛋白水解活性至關重要。對不同冠狀病毒的PLP2結構進行比較,結果表明IBV 與SARS-CoV PLP2之間存在4個區域的差別,這些差別分別位于Ubl 結構域的β1和β2鏈、拇指結構域的α1螺旋結構和手掌結構域;IBV 與MERS-CoV PLP2之間的差別則主要位于拇指結構域,MERS-CoV PLP2在這一區域有一個額外的β莖環結構[10],另外一個不同點在鋅指結構域。這些結構的差異可能會影響底物結合特異性,從而使病毒通過不同的信號轉導途徑干擾宿主細胞,創造利于病毒復制的環境。

      3、 PLPs的功能

      3.1 、PLP1的功能

      PLP1只存在于部分冠狀病毒屬病毒中,在編碼PLP1的病毒中,PLP1所介導的切割模式也不同。如α冠狀病毒屬的TGEV,PLP1切割nsp2/nsp3位點,也可能切割nsp1/nsp2和nsp3/nsp4位點,其切割位點P4至P1由KMGG肽組成,P1和P2位置由2個甘氨酸殘基組成[12];同屬的人類冠狀病毒HCoV-229E編碼的PLP1和PLP2均可切割nsp1/nsp2和nsp2/nsp3位點,但切割的效率不同;β冠狀病毒屬病毒2a亞組的MHV編碼的PLP1切割nsp1/nsp2和nsp2/nsp3位點,而PLP2只切割nsp3/nsp4位點。這些差異可能與冠狀病毒的進化有關,也可能與病毒蛋白的表達和病毒復制的調控有關[13]。除對病毒自身多聚蛋白進行切割外,PLP1還具有去泛素化酶(Deubiquitinases,DUBs)活性。泛素化修飾是蛋白翻譯后修飾的一種,病毒感染后宿主信號分子蛋白的泛素化修飾決定了信號通路的啟動、強弱及終止。泛素化-去泛素化是一個動態過程,DUBs作為蛋白泛素化的負向調控分子在病毒感染中發揮重要調控功能[14]。結構分析結果表明,泛素C末端序列LRGG類似于TGEV nsp2/nsp3位點的KMGG序列,可以被TGEV的PLP1識別后降解,PLP1的這一功能將破壞細胞泛素依賴性過程,抑制先天性抗病毒免疫反應,進而促進病毒復制。PLP1對不同泛素分子的降解能力不同,其可以同時降解Lys48-相連的多聚泛素鏈和Lys63-相連的多聚泛素鏈,但對前者的降解效率更高,Lys48-相連的多聚泛素鏈主要調控靶蛋白的蛋白酶體依賴性降解,PLP1通過降解該泛素鏈從而保護病毒蛋白不被降解[15,16]。TGEV的PLP1可通過去泛素化活性干擾視黃酸(維甲酸)誘導基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)和干擾素基因刺激物 (STING)介導的信號通路,抑制干擾素產生;此外,其還能抑制干擾素調節因子3(IRF3)的核移位,進一步阻止干擾素的產生[17]。人冠狀病毒NL63(HCoV NL63)PLP1可與宿主E3泛素連接酶RCHY1互作,增加后者的穩定性,誘導P53的降解,逃避宿主抗病毒天然免疫反應[18]。與其他冠狀病毒的PLP1不同,IBV編碼的PLP1不具有切割PP1a和PP1ab的蛋白酶活性。J. E. Philips等[19]比較了3組源于同一血清型的致病野毒株和經雞胚多次傳代而產生的減毒毒株的全基因組序列,發現34.75%~43.66%的氨基酸突變發生在nsp3上,其中大多數在PLP1區。因此,認為PLP1中的氨基酸突變可能與病毒毒性的減弱有關。

      3.2、 PLP2的功能

      PLP2的功能在所有冠狀病毒中都是保守的,它具有PLPs和DUBs雙重酶活性,也可通過不同途徑抑制干擾素的產生。在只編碼一個PLPs的冠狀病毒中,PLP2負責加工nsp1~nsp4所有位點,產生3個或4個蛋白(nsp1~nsp4,IBV沒有nsp1)。冠狀病毒PLP2可以與泛素或泛素樣因子結合,通過去泛素化宿主或病毒自身蛋白,創造利于病毒復制的環境,其與泛素結合位點均位于拇指、手掌和手指結構域的連接處,但不同冠狀病毒屬PLP2與泛素互作的氨基酸殘基有所不同,不同點主要表現在兩者間形成的一個鹽橋結構和3個氫鍵結構,這些不同可能會對PLP2的催化效率造成一定影響,使不同冠狀病毒的PLP2具有不同的底物特異性,對不同泛素分子的降解能力不同。IBV PLP2對Lys63-相連的多聚泛素鏈的降解能力強于對Lys48-相連的多聚泛素鏈[20];SARS-CoV PLP2則相反;而MERS-CoV的PLP2對兩種泛素鏈的降解能力類似,這種底物特異性差異將導致不同冠狀病毒PLP2靶向不同泛素化的宿主因子,通過不同途徑干擾宿主信號轉導,提供更有利于病毒復制的環境[21,22,23,24,25]。SARS-CoV 的PLP2可通過去泛素化抑制STING/TBK1/IKKε介導的信號轉導途徑,阻止IRF3 磷酸化,從而抑制Ⅰ型干擾素產生[26],也可通過降解IRF3 和 NF-κB上游調控子TRAF3 和TRAF6的Lys63-相連的多聚泛素鏈,抑制Toll 樣受體7(TLR7)介導的Ⅰ型干擾素的產生[27]。同時,PLP2還可以與宿主E3泛素連接酶RCHY1互作,增加后者的穩定性,誘導p53降解,抑制p53介導的干擾素的產生[18]。HCoV NL63 的PLP2可以通過去泛素化作用穩定MDM2,從而誘導p53降解,抑制p53-IRF7-IFN-β信號通路,以此逃避宿主抗病毒天然免疫反應[28]。與DUBS活性類似,冠狀病毒PLP2還具有抑制干擾素刺激基因產物15(interferon-stimulated gene 15, ISG15)的活性, ISG15的表達產物作為抗病毒天然免疫中重要的一員與泛素相似,可通過酶級聯反應與靶蛋白共價結合,參與腫瘤免疫應答、細胞凋亡、轉錄調控等多種生物學過程。研究結果表明,人源和鼠源ISG15具有抗病毒和調控干擾素信號通路的作用,冠狀病毒的PLP2可以與ISG15 C末端區域結合,將其從與ISG15結合的蛋白上去除,干擾宿主信號轉導途徑,抑制干擾素產生[29,30]。除上述酶活性外,PLP2還可與病毒其他蛋白互作。 SARS-CoV的PLP2功能區可以與其nsp2、ORF3a nsp4、nsp6和nsp12互作,調控病毒感染與復制[31,32];對MHV溫度敏感性突變體的分析結果表明,其PLP2結構域可以與MAC結構域互作,這一互作將影響病毒復制和致病力,也將影響病毒頡頏宿主天然免疫的能力[33];同時研究結果表明,與冠狀病毒的PLP2結構域相鄰的Ubls結構域對PLP2的酶穩定性至關重要,Ubl區域的突變可以改變該酶的活性,進而影響病毒復制和致病機制[34]。

      4 、疫苗研究進展

      IB防治以疫苗免疫為主。盡管IBV弱毒苗和滅活苗在IB的預防控制中起到了十分重要的作用,但由于IBV基因組的突變潛力和不同毒株間的重組危險性,且IBV疫苗易引起嚴重的上呼吸道支氣管反應,使得弱毒苗在理論上和實踐上都不可能從根本上防止IB的流行;滅活疫苗的使用劑量大,需要配合佐劑,制備過程比較復雜,成本較高。隨著對IBV基因組結構及功能研究的深入,人們逐漸轉向安全、高效、多價、廣譜的基因工程疫苗。基因工程疫苗是指在高效表達系統中表達出來的強毒病原體的某種免疫相關抗原,IBV的中和抗原主要存在于S1蛋白中,在N蛋白中也有少量存在。因此,對大多數基因工程苗的研究都集中S1蛋白上[35]。但IBV S1基因中和位點的高度構象依賴性一定程度上妨礙了S1亞單位蛋白疫苗啟動免疫的有效性,這會讓疫苗在不能與病毒匹配的時候不再那么有效。S1基因的點突變、插入、缺失或 RNA重組都可產生新血清型、亞型或變異株,這也是免疫雞群中暴發IB的主要原因。PLPs作為IBV nsp3中一個重要的功能區,其參與了切割病毒蛋白、去泛素化和抑制宿主抗病毒反應等一系列生物學過程,在病毒復制中起著重要作用,是一個重要的抗病毒靶點。且PLPs相對于S1基因更為保守,變異性較小,以其為靶點研制的抗病毒藥在不同的冠狀病毒屬之間不易因為基因的變異性而失效。鑒于PLPs的酶活性主要由催化位點的Cys-His-Asp催化三聯體決定,可以設計小分子化合物選擇性地結合該催化位點的氨基酸殘基,使其催化活性失活,起到抑制病毒復制以及抑制病毒對宿主抗病毒反應的頡頏作用。其次,PLPs的鋅指結構域對酶的活性也有重要影響,針對該區域設計的抑制劑也可以起到弱化病毒的作用[36,37,38]。然而,一些宿主的泛素特異性蛋白酶家族(USPs)活性位點的結構特點類似冠狀病毒的PLPs,也能競爭性地結合這些抑制物,因此如何增加底物結合的特異性是需要解決的問題。與此同時,一些去泛素化酶抑制劑也被用于治療臨床病毒性感染,鑒于PLPs具有去泛素化酶活性,也可以選擇性地使用去泛素化酶抑制劑對冠狀病毒感染進行防治。

      5 、展望

      近年來,反向遺傳學技術發展迅速,為研發以RNA病毒為載體的疫苗提供了新的思路和策略,該技術已經被應用于IBV疫苗的研制中,可通過反向遺傳學技術對PLPs基因進行修飾、選擇性地失活該蛋白某些功能以產生弱毒株,并圍繞該靶點蛋白開發有效的抗病毒藥物,對IBV進行防治。反向遺傳疫苗可能會解決弱毒疫苗所帶來的毒力反祖的問題,但這種新一代疫苗到底是會提高還是降低病毒突變和病毒選擇壓力還有待更多的研究。此外,IBV雖然保留了PLP1區,但已喪失蛋白酶活性,為什么喪失了酶活性的PLP1能在IBV的長期進化中被保留下來?它是否具有尚未被揭示的其他生物學功能?通過反向遺傳學體系研究該基因的生物學功能,將為深入理解IBV的致病機制以及研制新的抗病毒藥物提供設計思路。

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