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    腸道菌群的功能與檢測技術探究

    來源:原創論文網 添加時間:2018-07-25

    摘要

      Abstract:A large number of microorganisms are found in the gastrointestinal tract of animals, after a long period of evolution and selection, they form a dynamic microbial system. The interaction between intestinal flora and organism is very important for animals themselves. In recent years, it has become a hot topic. The function of intestinal flora is mainly reflected in biological barrier, nutrition and immunity. The detection method of intestinal flora is the important and difficult problem in the study of intestinal flora. The main techniques are isolation culture, mass-spectrometric technique and metagenomic sequencing technique. According to lots of references, the paper summarizes the current study results and research techniques for intestinal flora function.

      Keyword:intestinal flora; flora function; detection technique; isolation culture; mass-spectrometric technique; metagenomic sequencing technique;

      動物腸道內存在著大量的微生物, 這些微生物在經過長期的進化與選擇之后逐漸形成了一個動態的微生物系統。文章從腸道菌群的生物屏障作用、營養作用、免疫作用等方面介紹了腸道菌群功能, 總結了目前研究中常用的腸道菌群檢測技術———分離培養、質譜技術、宏基因組測序等, 并對幾種檢測技術進行對比和分析, 對未來可能的研究發展方向進行預測。

    腸道菌群的功能與檢測技術探究

      1、腸道菌群介紹

      腸道菌群, 即腸道內的正常微生物。人體的腸道菌群是一個由近1 014個微生物復合生態系統組成的復雜生態系統[1]。科學家對腸道微生物的研究可以追溯到1886年, 當時已經有人發現了大腸桿菌并指出其對消化的作用。后來又有學者提出了“梅氏假說”, 即酸奶中所富含的乳酸菌可以對腸道菌群產生作用, 減少腐敗菌在腸道中的生長。之后關于腸道菌群與機體關系的相關探索逐步加深, 科學家們逐漸發現腸道菌群對于宿主的重大影響, 并稱其為“被忽略的人體器官”。

      動物腸道內存在著30屬500多種細菌, 主要為厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌, 數量最多的為類桿菌、優 (真) 桿菌、消化球菌及雙歧桿菌等專性厭氧菌, 占99%以上, 其中僅類桿菌及雙歧桿菌就占細菌總數的90%以上。其余還有數量較少的大腸桿菌、腸球菌、乳桿菌及韋榮小球菌, 數量最少的葡萄球菌、魏氏梭菌、變形桿菌等。

      已有相關研究證實, 腸道菌群既有“共性”, 也有“個性”[2], 這主要體現在不同宿主體內的微生物菌群組成情況上。不同個體相比, 腸道菌群的主要組成類群非常相近, 并都可分為擬桿菌型、普氏菌型及瘤胃球菌型, 但微生物菌群的相對含量和菌株種類在不同個體間的差異卻十分顯著, 其影響因素主要為生存環境[3]、年齡[4]、生理狀況[5-6]等, 除此之外飲食也是造成以上區別的一個重要原因, 并且相對容易改變和控制。在各種因素影響著腸道菌群組成結構的同時, 腸道菌群也在對宿主的各個方面產生不同程度的作用與影響。目前, 腸道菌群已經成為科學家們研究的重點與熱點問題, 并且已經有許多相關研究取得了進展。

      2、腸道菌群的功能

      2.1、生物屏障作用

      腸道菌群的生物屏障作用即指頡頏外來致病菌的作用。早在1887年就已經有科學家觀察到微生物之間具有頡頏作用, 并利用這種頡頏作用成功預防和治療了家兔的炭疽病。1973年有人提出腸道菌群的減少可導致仔雞容易被致病性沙門氏桿菌感染。隨著科學家對腸道菌群的深入研究, 證實了腸道菌群具有保護機體、抵御外來致病菌的作用。

      腸道菌群的這種功能又被人為地劃分成生物屏障和化學屏障。生物屏障即指腸道正常菌群定殖于腸道中, 以此對外來致病菌的定殖占位造成影響, 使其無法在宿主體內定居生長和繁殖。而化學屏障是指腸道菌群代謝產物 (如乙酸、過氧化氫、細菌素等) 對外來致病菌能夠產生致命作用或者可以減少其在腸道內的定殖。

      2.2、營養作用

      腸道菌群的營養作用體現在多個方面。首先, 其可消耗致病菌生長所需要的各種營養物質, 從而抑制外來致病菌的生長繁殖, 并利用宿主體內不存在的酶彌補宿主在消化酶上的缺陷[7]。這種行為加強了宿主機體對外來致病菌的抵御作用, 并使得宿主對于各種營養物質的吸收利用能力更強。其次, 腸道的正常微生物 (如雙歧桿菌、乳酸桿菌等) 能合成多種人體生長發育所必需的維生素, 如B族維生素 (維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12) 、維生素K、煙酸、泛酸等, 還能利用蛋白質殘渣合成必需氨基酸, 如天冬門氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等, 并參與糖類和蛋白質的代謝, 同時還能促進鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收, 這些營養物質對于宿主的機體來說是必需的, 它們的缺乏會導致機體功能失常。細菌還可以通過氧化、還原、水解等反應使氨基酸脫氨產生氨、二氧化碳, 以及乙酸、丙酸、丁酸、丙酮酸、琥珀酸等有機酸。

      2.3、免疫作用

      腸道是動物與外界環境接觸最多的器官之一, 也是機體最大的免疫器官。腸黏膜中分布著超過全身半數的淋巴組織。腸道中定殖了大量的微生物。腸黏膜屏障包括機械屏障、免疫屏障與生物屏障。腸道正常菌群對腸黏膜免疫屏障功能的調控扮演著雙重角色。一方面, 腸道菌群作為抗原對腸黏膜存在潛在的危害;另一方面, 腸內寄生菌可為腸黏膜細胞提供某些營養成分, 維持腸道菌群平衡, 激活腸道免疫系統[8]。

      除此之外, 動物腸道菌群作為抗原物質還能促進宿主的免疫器官發育, 增加T、B淋巴細胞的數量, 產生非特異性免疫作用;通過對宿主免疫系統的持續刺激, 使其產生免疫反應來增加機體的免疫能力[9]。例如雙歧桿菌, 它是動物腸道內數量最多的有益菌, 含有腸道寄生菌共同抗原, 可以影響黏膜免疫的主要效用因子分泌性球蛋白, 在對機體的特異性與非特異性免疫上影響巨大[10]。

      已經有相關研究證明減少接觸微生物的機會, 會導致慢性炎性疾病的增多, 并指出這可能是導致機體免疫調節缺陷的一個重要原因。菌群失調時, 會導致機體的免疫紊亂和屏障功能減弱, 這也是證明腸道菌群與機體免疫之間關系緊密的一個方面[11]。

      在實踐和生產中, 腸道菌群已經有和疫苗混合使用來提高抗體水平和作為具有免疫活性的佐劑的應用。如在新城疫疫苗接種前后給雞喂食益生素, 可以提高雞血清中抗新城疫病毒血凝抑制抗體的含量并延長抗體的高峰期。光合細菌與H52混合使用, 可以提高雞體內的γ-球蛋白和雞傳染性支氣管炎病毒抗體水平。有關研究指出雙歧桿菌具有免疫佐劑活性。目前, 乳酸桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌已經被制成活菌制劑, 已有多種制劑被廣泛應用于微生物飼料添加劑和治療劑中, 用來防治動物腸道疾病。

      2.4、其他作用

      腸道菌群對機體除了具有屏障作用、營養作用和免疫作用之外, 還能對機體的造血功能產生直接或者間接的影響。有學者使小鼠腸道微生物消失導致其骨髓和外周血中粒細胞生成減少, 從而證明了這一觀點。腸道正常菌群可以產生超氧化物歧化酶, 使宿主體內的自由基歧化反應加速, 有一定的抗衰老作用。腸道菌群還能產生多種酶, 對腫瘤的產生有抑制作用[12]。腸道菌群對情緒也有影響, 還可通過腸-腦軸影響宿主的行為[13]。

      3、腸道菌群檢測技術

      3.1、分離培養

      分離培養是最早在試驗中使用的一種方法, 目前已經相對比較成熟, 應用于許多研究領域。該方法主要是利用選擇性培養基把各種細菌分離開, 并根據染色、生化反應、血清學試驗等方法對分離出的細菌進行鑒別, 這種方法還可以用來測定活菌的數量。例如, 徐鳳等[14]對2月齡斷奶羔羊、8月齡和2歲山羊瘤胃和回腸刮取物中的乳酸菌進行分離鑒定;白娜[15]利用純培養技術與16S r DNA技術結合對采集自內蒙古錫林郭勒牧區的36份健康家畜糞便樣品中的微生物進行了分離鑒定;聶遠洋等[16]利用不同培養基研究了不同年齡麥洼牦牛腸道菌群與其群落結構的變化。這種利用不同培養基分離培養細菌的方法雖然已經比較成熟, 能顯示出不同細菌對宿主腸道系統中各種營養物質的利用情況, 但也有一定的缺點, 如該方法不僅耗時長而且進行研究的微生物種類具有很大的局限性, 自然界中有90%~99%的微生物無法通過分離培養的方法進行分析, 顯然可分析的這一小部分微生物對研究腸道菌群這個整體和腸道微生物系統與宿主的關系來說是遠遠不夠的。

      3.2、質譜技術

      質譜技術是利用腸道菌群中不同菌種的組成蛋白種類不同這一特性來對蛋白質的種類進行鑒定, 從而得出其組成細菌的功能和特性的。基質輔助激光解析電離時間飛行質譜 (MALDI-TOF) 的出現, 成為從蛋白質水平對腸道菌群進行研究的有效工具。質譜技術的原理是利用激光輻射微生物樣品與等量基質溶液揮發后形成的晶體, 基質吸收能量解析而樣品分子電離, 對形成的離子峰與離子質荷比的指紋圖譜進行分析比較, 然后再進行比對區分出腸道菌群的種類。該方法在研究不同腸道菌群的種類時快速而準確, 可以區分不同菌群與不同狀態下的蛋白質圖譜。但這種方法對樣品的采集和處理要求較高, 且質譜技術的分析方法目前并不成熟, 還需進一步優化。

      3.3、宏基因組測序

      1998年宏基因組的概念被提出, 當時人們對它的定義是環境中所有微生物的遺傳信息, 目前主要是指環境中細菌和真菌基因組的和[17]。宏基因組測序技術又分為16S r DNA技術和全基因組測序技術。

      16S r DNA技術是目前腸道菌群系統分類研究中最常用的一種方法, 相較于5S和23S r DNA, 16S r DNA大小適中, 既容易獲取又能明顯比較出不同菌群的區別。16S r DNA技術的原理是通過直接獲取腸道菌群的DNA信息, 與基因庫中的數據進行比較, 經過分析后可以對其進行分類。目前所有已知細菌的16S r DNA堿基序列都已經可以在基因庫中找到, 這也為16S r DNA測定法在試驗研究中的廣泛應用奠定了基礎。王純等[18]用該方法對草魚與團頭魴的腸道菌群結構進行了比較分析, 提出了草魚和團頭魴消化道內微生物群落營養物質的代謝方式類似的觀點。這種技術解決了傳統的微生物鑒定方法難以鑒定眾多的生長習性復雜的微生物的問題, 目前已經在許多研究中被使用。但是16S r DNA技術的費用較高、耗時長且不能進行定量分析, 而且該技術依賴于PCR技術, 在PCR中存在的樣品容易污染的問題也會影響16S r DNA的分析結果, 所以仍需對腸道菌群豐度和數量準確變化的測定方法進行優化。

      全基因組測序即對樣品核酸進行提取, 測定其序列并對結果進行分析。測定過程中省略了擴增程序, 直接獲取核酸信息, 與數據庫中的信息進行比對, 經過分析后得出致病菌的種類, 用于檢測樣品中毒性菌株的耐藥性, 進行相關毒理學研究。高菽蔓等[19]利用全基因組測序研究了犬副流感病毒CC-14株全基因組序列特征。這種方法解決了傳統研究方法需要菌群分離的過程, 更快速、便捷, 也解決了有些菌種難以用傳統方法培養的問題。與16S r DNA技術相比不需要進行PCR擴增, 避免了擴增過程中樣品被污染的可能, 結果更準確可靠。目前, 這種方法被廣泛應用于腸道菌群和環境菌群的研究之中, 對于菌群的毒力作用與生活史的研究具有重要意義。

      3.4、其他技術

      分子標記法的靈敏性和特異性較高, 常見的具體方法有熒光原位雜交技術、基因芯片技術等。熒光原位雜交技術可以研究腸道細菌和其余組織之間的關系, 并且可以保持腸道菌群與腸道組織的原本情況。基因芯片技術即DNA微陣列, 具有在處理多個基因時高效快速的特點。

      DNA指紋圖譜分析法依賴于分析對象的分子大小與核酸序列的不同, 其中的變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 技術目前已經可以分辨出只有一個堿基差異的基因序列, 彌補了傳統研究方法精度不高的缺點, 被廣泛應用于微生物多樣性和種群差異的研究中。

      這些對腸道菌群的研究方法在使用時并不是唯一的, 在實際的研究中, 有時可能會兩種甚至多種方法并用進行鑒定研究。

      4、小結

      人們已經意識到了腸道微生物對于宿主機體的重要性, 不論是腸道菌群帶給機體抵御外來致病因素的屏障作用, 對于機體的營養作用、免疫作用, 還是其他作用, 對于宿主來說都是不能忽視的。失去了腸道正常菌群的作用, 機體會受到嚴重的損傷與一些功能的喪失。現在已經有許多的科學家投入到了腸道菌群的研究中, 為揭示腸道菌群與宿主之間的關系和影響作出了巨大的貢獻。但是這些研究成果對于腸道菌群與機體相互作用的整體來說仍然只是其中的一小部分, 仍然還有許多的內容等待學者們去研究。例如, 腸道菌群對宿主機體作用的機制目前尚未完全研究清楚, 腸道菌群是如何對宿主的健康甚至情緒產生影響的也尚無定論。

      相較于傳統的腸道菌群研究方法, 目前的技術手段已經取得了非常大的進步。但是這些技術仍然存在缺陷, 對于研究腸道菌群來說仍顯不足, 還需進一步優化, 如對于樣品的處理方式應有所突破, 對于腸道菌群的信息處理仍需優化。在未來, 期待有更簡便快捷的方法出現, 并結合目前已有的研究方法, 按照需求進行選取以更有效地達到試驗目的, 而借助生物大數據的方法可能會是未來研究的發展方向。

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